温度对红曲霉１５—１产桔霉素的影响水 李培睿，张晓伟，郭孝辉，余小娜 （许昌学院食品与生物工程学院，许昌摘４６１０００） 要：试验对不同温度对红曲霉１５ １在ＹＥＳ培养基上产桔霉素的影响进行了研究。通过ＨＰＬＣ法对 桔霉素的生成量进行动态检测，结果表明，温度对红曲霉生长及桔霉素浓度有较大影响。在试验温度范围内， ３５℃有利于红曲霉的生长，此温度条件下桔霉素产量则相对较低，而且随着培养时间的延长，桔霉素还可被红 曲霉分解利用，降解率可达７６．２２％。因此，红曲生产中可适当延长发酵时间，以降低红曲发酵产物中桔霉素 的浓度。 关键词：红曲霉；温度；桔霉素；ＨＰＬＣ 中图分类号：ＴＳ２０２．３ 文献标识码：Ａ 文章编号：１００６—２５１３（２０１５）０３—００８４—０４ Ｉｎｆｌｕｅｎｃｅ ｏｆ ｔｅｍｐｅｒａｔｕｒｅ ｏｎ ｔｈｅ ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ ｏｆ ｃｉｔｒｉｎｉｎ ｐｒｏｄｕｃｅｄ ｂｙ Ｍｏｎａｓｃｕｓ １ ５—１ ＬＩ Ｐｅｉ－ｒｕｉ，ＺＨＡＮＧ Ｘｉａｏ－ｗｅｉ，ＧＵｏ Ｘｉａｏ－ｈｕｉ，ＹＵ Ｘｉａｏ－ｎａ （Ｃｏｌｌｅｇｅ ｏｆ Ｆｏｏｄ ａｎｄ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ ｏｆ Ｘｕｃｈａｎｇ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ，Ｘｕｃｈａｎｇ ４６ １ ０００） Ａｂｓｔｒａｃｔ：Ｉｎｆｌｕｅｎｃｅ ｏｆ ｔｅｍｐｅｒａｔｕｒｅ ｏｎ ｔｈｅ ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ ｏｆ ｃｉｔｒｉｎｉｎ ｐｒｏｄｕｃｅｄ ｂｙ Ｍｏｎａｓｃｕｓ １ ５—１ ｃｕｌｔｉｖａｔｅｄ ｉｎ ＹＥＳ ｃｕｌｔｕｒｅ ｍｅｄｉｕｍ ｗａｓ ｓｔｕｄｉｅｄ．Ｔｈｅ ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ ｏｆ ｃｉｔｒｉｎｉｎ ｗａｓ ｄｅｔｅｃｔｅｄ ｄｙｎａｍｉｃａｌｌｙ ｂｖ ＨＰＬＣ．Ｒｅｓｕｌｔｓ ｓｈｏｗｅｄ ｔｈａｔ ｔｅｍｐｅｒａｔｕｒｅ ｈａｓ ｌａｒｇｅｒ ｅｆｆｅｃｔｓ ｏｎ ｔｈｅ ｇｒｏｗｔｈ ｏｆ Ｍｏｎｃｔｓｃｕｓ ａｎｄ ｃｉｔｒｉｎｉｎ ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎ．Ｉｎ ｔｈｅ ｒａｎｇｅ ｏｆ ｔｅｓｔ ｔｅｍｐｅｒａｔｕｒｅ，３５ ｏＣ ｗａｓ ｂｅｎｅｆｉｃｉａｌ ｔｏ ｔｈｅ ｇｒｏｗｔｈ ｏｆ Ｍｏｎａｓｃｕｓ．ａｎｄ ｂｕｔ ｎｏｔ ｇｏｏｄ ｔｏ ｔｈｅ ｙｉｅｌｄ ｏｆ ｃｉｔｒｉｎｉｎ．Ｗｉｔｈ ｔｈｅ ｅｘｔｅｎｄｉｎｇ ｏｆ ｉｎｃｕｂａｔｉｏｎ ｔｉｍｅ，ｃｉｔｒｉｎｉｎ ｃｏｕｌｄ ｂｅ ｄｅｇｒａｄｅｄ ａｎｄ ｒｅｕｔｉｌｉｚｅｄ ｂｙ Ｍｏｎａｓｃｕｓ，ａｎｄ ｄｅｇｒａｄａｔｉｏｎ ｒａｔｅ ｗａｓ ７６．２２％．Ｔｈｅｒｅｆｏｒｅ，ｉｎ ｔｈｅ ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ ｏｆ Ｍｏｎａｓｃｕｓ ｐｉｇｍｅｎｔ，ｔｈｅ ｆｅｒｍｅｎｔａｔｉｏｎ ｔｉｍｅ ｓｈｏｕｌｄ ｂｅ ｌｏｎｇｅｒ ｓｏ ｔｈａｔ ｔｈｅ ｔｒｉｎｉｎ ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎ ｃａｎ ｂｅ ｌｏｗｅｒｅｄ ｉｎ ｔｈｅ ｆｅｒｍｅｎｔａｔｉｏｎ ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ． Ｋｅｙ ｗｏｒｄｓ：Ｍｏｎａｓｃｕｓ；ｔｅｍｐｅｒａｔｕｒｅ；ｃｉｔｒｉｎｉｎ；ＨＰＬＣ 由红曲霉发酵产生的红曲色素是一种安全性 菌的次生代谢产物，具有肾毒性，还可致畸、致 癌和诱发基因突变等１２－３ｌ。桔霉素的存在已成为 我国功能性红曲应用和出口的瓶颈。因此，采用 高、营养价值丰富、用途较广、色素种类较多的 传统天然色素，已有几千年的应用历史，不仅可 以应用于腐乳、红曲酒等传统食品产业，还可以 应用于肉制品、鱼酱等现代食品产业中…。然 新型生产工艺、优化发酵条件、应用菌种筛选等 现代技术，研发富含活性物质且不含桔霉素的功 能性红曲色素已当前的研究热点。很多报道表明 红曲霉的生长、红曲色素及桔霉素的产量受很多 而，真菌毒素桔霉素（Ｃｉｔｒｉｎｉｎ）的发现使红曲 色素的使用安全性受到了挑战。桔霉素是红曲 收稿日期：２０ｌ４—１１ ０７ 基金项目：河南省教育厅科学技术研究重点项目（１３Ｂ１８０２４２）；许昌学院校内科研项目（２０１４００９）。 作者简介：李培睿（１９７３～），女，副教授，研究方向：食品微生物。 因素的影响，如碳源、氮源、温度、溶氧、ｐＨ 等［４－７］。温度是一种重要的环境因子，对微生物 的生长及次级代谢产物的产量都有重要的影响。 但在发酵中温度对红色素与桔霉素产量关系的变 化方面的研究较少报道。本文利用ＹＥＳ培养基， 考察了不同温度对液体发酵条件下红曲霉１５—１ 合成桔霉素的影响，研究桔霉素产量与温度之间 的关系，以期利用温度控制发酵，增加有用代谢 产物（红曲色素）的产量，降低或消除对人体有 害的副产物（桔霉素）的合成，提高红曲产品在 食品应用中的安全性。 ｌ实验材料 １．１菌种 红曲霉１５—１（Ｍｏｎａｓｃｕｓ １５—１）：许昌学院食 品科学与工程学院微生物实验室选育保存。 １．２培养基 菌种保藏培养基：蒸馏水１０００ｍＬ，麦芽汁 １３０ｇ，琼脂２０ｇ，在１２１℃灭菌３０ｍｉｎ。 种子培养基：糯米粉３Ｏ ｇ，ＫＨ２ＰＯ ２．５ｇ， ＮａＮＯｓ ２．０ｇ，ＭｇＳＯ ’７ Ｈ２Ｏ １．０ｇ；用乳酸调ｐＨ 至４．５左右，１２１℃灭菌１５ｍｉｎ。 ＹＥＳ培养基：分别称取蔗糖８ｇ，酵母浸膏 ２ｇ于两只盛有５０ｍＬ蒸馏水的锥形瓶中，摇匀， 分别于１２１℃下灭菌１５ｍｉｎ，待冷却至常温，在 无菌环境下将两者合并。 １．３主要实验试剂及设备 无水乙醇（分析纯）、乙腈（色谱纯）、甲醇 （色谱纯）、桔霉素标准品（≥９９．９９％，Ｓｉｇｍａ）、 ＬＣ一１０ ＡＴＶＰ型高效液相色谱仪 ２实验方法 ２．１红曲霉培养方法 ２．１．１菌种的保藏 将红曲霉接种于菌种保藏培养基中３７℃培养 ７～９ｄ，菌种在４￣Ｃ下保藏，每隔一月活化一次。 ２．１．２红曲霉的种子培养 将新鲜的菌种斜面加入适量无菌蒸馏水，用接 种环将斜面中的孢子刮掉，制成菌悬液，接人种子 培养基中，３７℃１８０ｒ／ｍｉｎ培养３０ｈ，得到种子液。 塑 ２．１．３红曲霉的液体发酵 将上述种子液在无菌操作台上用双层无菌纱 布过滤，将过滤后的种子液混合均匀，以５％接 种量取滤液加入ＹＥＳ培养基中，分别于２０℃、 ２５℃、２８℃、３０℃、３５℃恒温培养箱中静置培 养。从发酵第４ｄ开始，每隔２４ｈ进行取样，测 量发酵过程中桔霉素量和菌丝干重。 ２．２分析测定方法 ２．２．１菌丝干重的测定方法 将发酵液进行过滤，将过滤后的菌丝放入已 称量过的培养皿中，于６０℃烘箱中进行干燥至 恒重。 ２．２．２桔霉素的测定方法［ （１）样品预处理 量取一定量的发酵液，加入二倍体积８０％乙 醇溶液，混合均匀，于黑暗环境中过夜。然后放 于６０℃水浴锅中加热６０ｍｉｎ，每隔２０ｍｉｎ振荡一 次，最后４０００ｆｆｍｉｎ离心１５ｍｉｎ，取上清液待测。 （２）高效液相色谱条件 色谱柱：ＳｈｉｍａｄｚｕＶＰ—ＯＤＳＣ１ ８（５ ｍ， １５０ｍｍ×４．６ｍｍ），Ｓｈｉｍａｄｚｕ ＶＰ—ＯＤＳ Ｃｌ８（５岬， ２５０ｍｍ×４．６ｍｍ）；流动相：乙腈、甲醇与 水（ｐＨ ２．５）的混合液，Ｖ（乙腈） ：Ｖ（甲 醇）：Ｖ（水）＝７０：１０：２０；检测器：荧光 检测器，检测波长为２ｅｘ＝３３ｌｎｍ，２ｅｍ＝５００ｎｍ； 柱温：室温；流速：ｌｍＬ／ｍｉｎ。 （３）桔霉素含量的计算 准确配置桔霉素标准样品，用ＨＰＬＣ法进行 测定，得出桔霉素质量浓度与峰面积线性回归方 程和相关系数。然后用ＨＰＬＣ法分别对稀释后的 发酵液进行测定，得出各个发酵液的色谱图及其 峰面积值。将测出的各发酵液峰面积代入标准样 品线性回归方程可以得出各发酵液的稀释质量浓 度。再将该稀释质量浓度乘以该发酵液的稀释倍 数，得出该发酵液的实际质量浓度，该质量浓度 即为该发酵液中桔霉素的含量。 ３实验结果 ３．１温度对红曲霉菌丝干重的影响 将抽滤后的菌丝，放入６０℃烘箱中，每隔 ＣｈｉｎａＦｏｏｄＡｄｄｉｔｉｖｅ￣ 试验研究 １ｈ称量一次，直至恒重，得出不同温度下菌丝干 列 叫 中国食品添加剂 重与时间的变化关系，如下表１所示： 表１不同温度下菌丝干重（ｇ）与时间的变化 ∞ 一～ ㈨ ＂ 甜 一 一～ 一 一 一 一～ 一 一 Ⅲ ＂ ～ 一 一 一 一 一 一 一 一 一 一 一 ＝ ： 蔓避 蕞 嚣 ‘ ０ 注：“一”表示在此温度和时间下无取样。 由表１可知，在试验的五种温度下红曲霉 菌丝干重随着时间的延长都会出现不同程度的增 加，温度越高红曲霉生长速度越快即菌丝干重 越大，如在第５ｄ时，３５℃、３０℃下菌丝干重分 别为１．２７ｇ、０．９７ｇ；而在同一温度条件下，如， ３５℃培养条件下，第５ｄ至第９ｄ的菌丝干重分别 为１．０６ｇ、１．２７ｇ、１．６１ｇ、１．９２ｇ、２．０２ｇ，说明红 曲霉在其生长早期菌丝干重呈现上升趋势，而 在生长后期因为营养物质匮乏，菌丝干重趋于 稳定。 ３．２温度对桔霉素合成的影响 ３．２．１桔霉素标准曲线的绘制 准确配置质量浓度分别为０．２５ｇｇ／ｍＬ、０．５ｇｇ／ ｍＬ、２．０￣ａｇ／ｍＬ、５．Ｏｇｇ／ｍＬ、１０．Ｏｐｇ／ｍＬ的桔霉素 标准样品，进样量为２０ｐＬ，用ＨＰＬＣ法进行检 测，以峰面积为横坐标，桔霉素质量浓度为纵坐 标，得出桔霉素质量浓度与峰面积的线性关系， 结果如图１所示： ＂ 一Ⅲ 一 一 一２ｏｏ 一 喜００ ８００ 嚣００ 涟蠢 嘶 图１桔霉素标准曲线 根据标品质量浓度和峰面积可求出回归方 程和相关系数，得到标准曲线方程ｙ＝Ｏ．０１７３ｘ一 ０．０３６，Ｒ２：０．９９９３， 由此可知在０．２５～ ｌＯｐｇ／ｍＬ范围内桔霉素的质量浓度与峰面积成线 埘 性关系。 ３．２－３温度对桔霉素合成的影响 ＂ 用ＨＰＬＣ法测定不同温度下各发酵样液，可 以得出各不同温度下各发酵液的峰面积，代人标 准样液线性回归方程即可得出各发酵液的质量浓 ～度，其结果如表２所示： 表２不同温度下桔霉素合成量（ 咖Ｌ）的变化 一一 一 一 一注：“一”表示在此温度和时间下无取样。 ∞ 呲 矧 一 ％ ∞ 一 由表２可知，在试验的五种温度条件下桔 霉素的产量都会随时间的延长而增加，温度越高 桔霉素产生的越早且产量越高。通过对所取样品 在３５℃、３０℃、２８℃、２５℃、２０￣Ｃ最高桔霉素产 量进行对比可知，其最高产量分别达到８８．５８ ｍＬ、１００．３７ ｋｔｇ／ｍＬ、ｌ６７．０９￣ｔｇ／ｍＬ、８４．２４￣ｔｇ／ ｍＬ、２．０２￣ｔｇ／ｍＬ，由此可知，红曲霉液体发酵时， ３０℃、２８℃时红曲霉产生桔霉素的总量达到最大 １００．３７￣ｔｇ／ｍＬ、１６７．０９／．ｔｇ／ｍＬ，这明显高于３５℃红 曲霉桔霉素产量８８．５８ｔｘｇ／ｍＬ，因此在发酵红曲色 素时，在不影响红曲色素产量时，尽可能避开桔 霉素的最佳产生温度。 桔霉素属于次级代谢产物，在其快速生长期 后期形成，从３５℃培养条件下桔霉素产生动态 图中可以看出，桔霉素在其整个形成过程中先增 加，在第６ｄ达到最大值８８．５８￣ｔｇ／ｍＬ，然后开始 下降，第９ｄ时发酵液中桔霉素浓度为２１．０６ｐｇ／ ｍＬ。其他几组温度也出现了同样先增加再下降的 趋势，分析其原因，可能是由于桔霉素和红曲色 素具有较接近的分子结构，在发酵后期由于营养 物质缺乏，红曲霉将桔霉素分解，以便维持红曲 色素的合成。因此在利用红曲霉发酵生产红曲色 素时，可以适当延长发酵时间，使红曲发酵产物 中桔霉素降解到最低，这样有益于生产安全、卫 生的红曲色素。 ４结论 （１）温度的升高有利于红曲霉的生长，在所 选温度范围内３５℃的红曲霉菌丝干重值为最大。 （２）在ＹＥＳ培养基中，红曲霉于２８℃时桔 霉素产量达到最高值１６７．０９￣ｔｇ／ｍＬ，明显高于 ３５℃桔霉素产量８８．５８￣ｇ／ｍＬ，因此，红曲霉产桔 霉素的最佳温度应该是在２８￣Ｃ左右。因此在不影 响红曲色素产量时，尽可能避开桔霉素的最佳合 成温度。 （３）在同一温度条件下，随着培养时间的 延长，桔霉素的产量呈现出先上升，后下降的趋 势，如在３５℃培养条件下，６ｄ桔霉素的产量为 ８８．５８￣ｔｇ／ｍＬ，９ｄ时则下降为２１．０６￣ｔｇ／ｍＬ，降解率 可达７６．２２％。 堕塑 嘉 慧 （４）由以上实验结果可知，在所选温度范围 内，３５℃有利于红曲霉的生长，桔霉素产量则相 对较低，而且继续培养后，桔霉索还可被红曲霉 分解利用，使发酵液中桔霉素的浓度大大降低。 因此，可适当延长发酵时间，使红曲发酵产物中 形成的桔霉素再被降解，以利于生产安全、卫生 的红曲色素。 ５展望 红曲色素作为一种天然色素，在食品行业具 有很好的应用前景，但是桔霉素的检出严重制约 了其在食品行业的应用，温度作为一种重要的环 境因素，研究其对桔霉素和红曲色素色价的影响 显得至关重要，而本文仅就温度对桔霉素的影响 进行了试验，缺少对红曲色素色价的研究，下一 步需着重研究温度对红曲色素色价的影响，以找 出适宜产出高色价红曲色素而桔霉素产量达到最 低时的最适温度，从而为生产安全可靠的高色价 红曲色素提供理论基础。 参考文献： ［１］殷贺中，祝美云．红曲霉次级代谢产物的研究［Ｊ］．农产品加 工学刊，２０１０（１２）：７－９． 【２ｌ王春娜，马美荣．红曲霉桔霉素［Ｊ】．中国食品添加剂，２００６ （５）：１０７—１０９． ［３】Ｃｉｅｇｌｅｒ Ａ，Ｖｅｓｏｎｄｅｒ Ｒ Ｆ，Ｊａｃｋｓｏｎ Ｌ Ｋ．Ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ ａｎｄ ｂｉｏｌｏｃａｌ ａｃｔｉｖｉｔｙ ｏｆ ｐａｔｕｌｉｎ ａｎｄ ｃｉｔｒｉｎｉｎ ｆｒｏｍ Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｒｎ ｅｘｐａｎｓｕｍ［Ｊ］．Ａｐｐｌｉｅｄ ａｎｄ Ｅｎｖｉｒｏｎｍｅｎｔａｌ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ，１９７７， ３３（４）：１００４—１００６． 【４】邢淑婕，刘开华．培养条件对红曲霉产红曲红色素及桔霉素 影响的研究［Ｊ】．中国食品添加剂，２０１０（１）：ｌｌ２一ｌ１５． ［５】Ｈａｓｓａｎ Ｈａｊｊａｊ，Ｊｅａｎ—Ｍａｒｉｅ Ｆｒａｎｃｏｉｓ，Ｇ ｅｒａｒｄ Ｇｏｍａ，ａｎｄ Ｐｈｉｌｉｐｐｅ Ｊ．Ｂｌａｎｃ．Ｅｆｆｅｃｔ ｏｆ Ａｍｉｎｏ Ａｃｉｄｓ ｏｎ Ｒｅｄ Ｐｉｇｍｅｎｔｓ ａｎｄ Ｃｉｔｒｉｎｉｎ Ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ ｉｎ Ｍｏｎａｓｃｕｓ ｒｕｂｂｅｒ［Ｊ］．Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｆｏｏｄ Ｓｃｉｅｎｃｅ，２０１２，７７（３）：１５６—１５９． ［６】Ｓａｂａｔｅｒ—Ｖｉｌａｒ Ｍ，Ｍａａｓ Ｒ Ｆ，Ｆｉｎｋ—Ｇｒｅｍｍｅｌｓ Ｊ．Ｍｕｔａｇｅｎｉｃｉｔｙ ｏｆ ｃｏｍｍｅ￣ｉａｌ Ｍｏｎａｓｃｕｓ ｆｅｒｍｅｎｔａｔｉｏｎ ｐｒｏｄｕｃｔｓ ａｎｄ ｔｈｅ ｒｏｌｅ ｏｆ ｃｉｔｒｉｎｉｎ ｃｏｎｔａｍｉｎａｔｉｏｎ［Ｊ］．Ｍｕｒａｔ Ｒｅｓ，１９９９，４４４（１）：７—１６． ［７］Ｓｕｍａｔｈｙ Ｂａｂｉｔｈａ ｌ，Ｃａｒｌｏｓ Ｒｉｃａｒｄｏ Ｓｏｃｃｏ，Ａｓｈｏｋ Ｐａｎｄｅｙ． Ｅｆｆｅｃｔ ｏｆ ｓｔｒｅｓｓ ｏｎ ｇｒｏｗｔｈ，ｐｉｇｍｅｎｔ ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ ａｎｄ ｍｏｒｐｈｏｌｏｇｙ ｏｆ Ｍｏｎａｓｃｕｓ ｓｐ．ｉｎ ｓｏｌｉｄ ｃｕｌｔｕｒｅｓ［Ｊ］．Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｂａｓｉｃ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ，２００７，４７：ｌ１８—１２６． ［８】钱志伟，杨丹丹，徐前景，等．ＨＰＬＣ法测定酯化红曲霉发 酵液中桔霉素含量［ＪＪ．酿酒科技，２０１０（３）：１０７—１０９． 【９】班昭，王昌禄，陈勉华，等．红曲霉发酵液中桔霉素快速检 测方法的优化［Ｊ】．氨基酸和生物资源，２０１０，３２（２）：７０— ７３．